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Scientific Reports volume 12、記事番号: 9483 (2022) この記事を引用

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メトリクスの詳細

RNA および DNA 送達用の脂質ナノ粒子 (LNP) は、広範囲の疾患を治療し、新型コロナウイルスワクチン用の mRNA をベクター化できるため、大きな注目を集めています。 LNP は生体分子と脂質を混合することによって生成され、これらは自己集合して目的の構造を形成します。この領域において、マイクロ流体工学は、高い混合品質、低ストレス条件、迅速な調製といった明らかな利点を示しています。マイクロミキサーで生成された LNP の研究により、特定の流量範囲では、サイズ、単分散性、およびカプセル化効率の点で性能が低下することが明らかになりました。この研究では、高スループットに適したリングマイクロミキサーに焦点を当てます。デバイスの混合パフォーマンスを制御する、サイドバイサイド、過渡的、および高度に混合された 3 つの状態を明らかにします。さらに、低温 TEM および生化学分析を使用して、混合性能が製造する LNP の特性と強く相関していることを示しました。我々は、流量比の重要性を強調し、形状、単分散性、カプセル化収率の点で最適な特性を備えた LNP を製造するための、時間的不安定性の開始に基づく物理的基準を提案します。これらの基準は一般的に適用可能です。

過去 10 年間に多くの進歩が見られました。実際、今世紀初頭に最初のマイクロミキサーが登場して以来、さまざまなコンセプトに基づいた約 100 の機能デバイスが開発されてきました。それらにはすべて長所と短所がありますが、全体として、ユーザーはマイクロ流体ミキサーのカタログで関心のあるアプリケーションに対応する形状を見つけることがよくあります1、2、3。近年、これらのデバイスを使用して LNP (脂質ナノ粒子) を生成するというアイデアが浮上しています 4,5。 LNP は、核酸送達のゴールドスタンダードとして浮上しています6。これらは直径 50 ～ 100 nm の複雑なナノ粒子であり、主にカチオン性イオン化脂質で構成されており、電荷が中和されると他の脂質成分から分離することができ、これにより LNP のコアに非晶質の油滴が形成されます。最近の研究7、8。 LNP 内の治療用分子は用途によって異なります。 DNA、mRNA、または siRNA の場合があります。界面で捕捉または吸着される機能実体には、PEG 部分 (通常は脂質鎖に結合)、ヘルパー脂質、およびコレステロールが含まれます。脂質ナノ粒子は、高い核酸カプセル化効率、より強力なトランスフェクション、改善された組織浸透性、低い細胞毒性および低い免疫原性など、以前の脂質ベースの核酸送達システムに比べて多くの利点を提供します。新型コロナウイルスに対するmRNAベースのワクチンで実証されているように、これらの特性により、脂質ナノ粒子は核酸送達の優れた候補となる。

LNP は自己組織化プロセスを通じて形成されます。数値シミュレーションによると、自己集合プロセスには、円盤状クラスターへの粒子集合、より大きな膜パッチへのクラスターの凝集、および小胞形成の 3 つのステップが含まれることが示唆されています9。拡散による自己組織化では時間がかかりすぎるため (数日かかります)、流体力学的混合が必要になります。大型容器での標準ミキサー5の使用はオプションです。ただし、これらのミキサーでは、カプセル化効率が低くなり、サイズの多分散性が生じます。したがって、この方法で製造された LNP の品質を向上させるには、濾過、押出、遠心分離などの後処理ステップが必要です。これに関連して、マイクロ流体ミキサーの使用が関連します。最近、マイクロ流体工学により、単分散性およびカプセル化収率の点で許容できる品質の LNP を単一ステップで高収率で製造できることが実証されました。 Fujishima et al.10 および Shepherd et al.11 では、千鳥配置のヘリンボーンマイクロミキサー 12 が使用されています。ヘリンボーンマイクロミキサーの限界の 1 つは、スループットが低いことです。この制限は、システムを並列化することで回避できます11。ただし、このオプションでは複雑さが生じ、コストが増加し、信頼性が低下します。大幅に高い流量で動作し、より高いスループットを実現する慣性マイクロミキサーが解決策を提供しますが、これまでのところ、文献でいくつかの兆候が見られるものの、機能的な LNP を得るためにマイクロミキサーを動作させるべき条件はまだ完全には解明されていません。

本論文では、慣性マイクロミキサーの一種であるディーンベースのマイクロミキサー 13,14,15,16,17 に焦点を当てます。高スループット、つまり大量生産に適しています。数値計算 18 とよく一致して、流量の 3 つの領域を特定します。そのうちの 1 つは「移行領域」と呼ばれ、最適な流れ条件を特定する上で重要な役割を果たします。カプセル化効率 (EE)、サイズ、電荷、単分散性の点で最適な特性を備えた LNP を得るには、遷移領域を超える流量で操作する必要があることを示します。流量に関しては、移行レジーム以下または移行レジーム内で作業すると、パフォーマンスの低下につながります。したがって、文献と一致して、これまでに提案されていない物理的基準を使用して、許容可能な品質のLNPが得られる物理的条件の概要を説明します。また、水相 (核酸を含む) と有機相 (脂質を含む) の間の流量比の重要な役割についても説明します。

当社の LNP 製剤では、1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン (DOPC)、1,2-ジミリストイル-rac-グリセロ-3-メトキシポリエチレングリコール-2000 (DMG-PEG2000) およびコレステロール (植物由来) が含まれていました。 Avanti Polar Lipids (米国アラバマ州アラバスター) から購入しました。Ｄｌｉｎ－ＭＣ３－ＤＮＡ（以下、ＭＣ３と呼ぶ）は、ＳＡＩＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅ（インド、ハイデラバード）から入手した。クエン酸および三塩基性クエン酸ナトリウム二水和物は、Sigma-Aldrich (フランス) から入手しました。リン酸緩衝生理食塩水 10X (PBS、pH 7.4) は Thermo Fisher Scientific (フランス) から入手しました。 gWiz-GFP プラスミドは Aldevron (米国ノースダコタ州) から購入しました。

LNP を生成するために、MC3、DOPC、コレステロール、PEG 脂質のモル比がそれぞれ 50:10:38.5:1.5 になるように脂質をエタノールに可溶化しました。脂質混合物を、ＮｘＧｅｎマイクロ流体カートリッジ（ＰｒｅｃｉｓｉｏｎＮａｎｏＳｙｓｔｅｍｓ、Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ製）を使用して、ｐＤＮＡを含有するｐＨ４の５０ｍＭクエン酸緩衝液と混合した。イオン化脂質と pDNA の間の窒素対リン酸比 (N/P) は 6 に維持しました。流速 (FR; 0.4 ～ 20 mL/min の範囲)、水性対有機比 (FRR; から1:1 ～ 10:1)、最終脂質および pDNA 濃度 (脂質および pDNA について、それぞれ 1.44 ～ 15 mg/mL および 93 ～ 965 μg/mL) を評価しました。すべての配合物について、初期廃棄物量と最終廃棄物量はそれぞれ 0.45 mL と 0.05 mL に設定されました。配合物をマイクロミキサーで処理した後、生成物からエタノールを除去し、Amicon Ultra Centrifugal Filters (EMD Millipore、マサチューセッツ州ビレリカ) を使用して PBS によってクエン酸緩衝液を除去しました。最終的に配合物を 0.22 μm フィルターに通し、使用するまで 4 °C で保管しました。

粒子サイズ、多分散指数 (PDI)、およびゼータ電位は、Malvern Zetasizer NanoZS (英国ウースターシャー) を使用した動的光散乱によって測定されました。 LNP を PBS で 100 倍に希釈し、μ-キュベットに加えました。分散剤 (PBS) の屈折率 (RI) と粘度の値はそれぞれ 1335 と 1.02 cP でしたが、材料の RI は 1.45 でした。

pDNA カプセル化効率は、PicoGreen DNA アッセイ (Life Technologies、オンタリオ州バーリントン) を使用して測定しました。簡単に説明すると、TE バッファー中の 1% (w/v) Triton-X100 の存在下または非存在下で、100 μL の希釈蛍光色素を 100 μL の希釈 LNP に添加し、光の非存在下で 5 分間インキュベートしました。核酸は、蛍光光度計 (Varioskan Lux Microplate Reader、Thermo Fisher) を使用して蛍光 (ex/em = 480 nm/520 nm) を測定することによって定量されました。キットに付属の標準 DNA サンプルを使用して、最大 1000 ng/mL までの直線検量線を実行しました。

内包率は以下の式により算出した。

LNP の形態はクライオ電子顕微鏡で観察されました。 ELMO イオナイザー (コルドゥアン、フランス) で 90 秒間のグロー放電後、合計 4.1 μL の濃縮 LNP を Quantifoil R2/2 銅 300 メッシュグリッド (Quantifoil Instruments GmbH、ドイツ) 上に堆積しました。 Vitrobot MARK IV (Thermo Fisher Scientific、米国) を使用してグリッドをブロッティングおよび凍結し、910 クライオホルダー (Gatan, Inc.、米国) を使用して 200 kV で動作する TEM tecnai-G20 (ThermoFisher Scientific、米国) に移しました。観察。画像は、ssCCD Ultrascan 4000 (Gatan, Inc.、米国) を使用して、4 μm デフォーカスおよび低線量モード (10 ～ 15 e-/Å2 の電子線量) で記録されました。記録された画像のピクセルサイズは、ピッチ間隔 500 nm および 2000 本/mm のクロスライングリッド (EMS、米国) を使用した TEM キャリブレーション後、0.221 nm と推定されました。

LNPの製造に使用されるマイクロ流体デバイスを図1に示します。

(A) フルオレセイン溶液で満たされたマイクロデバイスの画像。 (B) セクションを示すマイクロデバイスのスケッチ。 1、エントリー領域、およびセクション。 4 つのリングとそれらの間の接合部を含む。流体モデル実験では、Q1 は水、Q2 は 0.1% w/w フルオレセインを含むエタノールです。 LNP 実験では、Q1 は酸性緩衝液で希釈された核酸を含む水相を表し、Q2 は脂質を含むエタノール相を表します。 (C) デバイスの三次元図。微細加工の成形技術に関連するウェッジを示しています。チャネルの寸法は光学的形状測定法によって測定されました (図 2 を参照)。

このシステムには、直線チャネルで接続された一連の 4 つのトーラスが含まれていました。このデバイスは、プラスチック成形技術 (カナダ、ブリティッシュコロンビア州バンクーバーの Precision NanoSystems Inc. Ltd. の Ignite®) を使用して微細加工されました。図 2 は、挿入図に示すように、4 つのリングの下流に位置する出口チャネルの断面を示しています (白い破線を参照)。

出口チャネルの断面プロファイル (挿入図の破線を参照)。y は水平寸法 (つまり、デバイスの平面内) を表し、z は高さを表します。したがって、関数 z(y) は、チャネル底部を基準 (z = 0) としてチャネルプロファイルを定義します。 2 セットのデータが示されています: 蛍光強度と z(y) の間の比例関係を仮定した強度測定値 (丸)、および Veeco 光学プロフィロメトリー測定値 (赤線)。

図2のプロファイルは、チャネルをアルコールとフルオレセインの溶液で満たし、蛍光顕微鏡で画像化し、カメラで強度場を収集し、画像をコンピュータで分析することによって得られました。チャネルの高さが大きいほど、収集される強度は強くなります。漂白を避けるために低いフルオレセイン濃度 (0/1% w/w) で作業し、カメラによって収集された蛍光強度とチャネルの高さとの間に比例性があると仮定しました。この方法で得られたプロファイルが光学式表面形状測定法と完全に一致していることを確認しました (光学式表面形状計 Veeco で取得した図 2 の赤い線を参照)。使用された微細加工技術 (射出成形) により、流路壁は垂直ではなく、わずかに傾斜していました。図2から、約80°の角度が得られ、高さが一定のチャネルの中央部分との対向によっていわゆる「くさび」を形成します。これに関連して、チャネル幅 w を、中央平面レベルでの 2 つの傾斜壁間の距離として定義します。混合解析では、これらのくさびを無視し、生成したい材料のほとんどを輸送する中央部分に焦点を当てます (くさび内では流体が閉じ込められているため、中央と同じ圧力勾配にさらされます)の一部は本質的に停滞しており、生産プロセスには寄与していないと考えられます)。光学的形状測定から推定された表面粗さは 3 ± 1 μm でした。これは、表面後処理を行わない射出技術の典型的な例です。流れは乱流の開始よりかなり下で駆動されるため (以下を参照)、この粗さは力学的な役割を果たしません。

チャネルは同じ深さ（155 μm - 光学的形状測定法で測定 -）と異なる幅を持っています。図 1 では、トーラスの幅は 150 μm、接続チャネルの幅は 150 μm、入口チャネルと出口チャネルの幅は 280 μm です (図 2 を参照)。このデバイスには 2 つの入口があります。入口チャネルは、最初のトーラスに接続された Y 字形を形成します。

総流量は Q = Q1 + Q2 で定義されます。ここで、Q1 と Q2 は 2 つの入口で注入される流体の流量です (図 1 を参照)。私たちのシステムでは、次の 2 種類の実験が実施されました。

モデル流体実験: この場合、Q1 は脱イオン水に対応し、Q2 は質量濃度 0.1% のフルオレセインエタノール溶液に対応します。

LNP 実験: この場合、Q1 は酸性緩衝液中に核酸を含む水相を表し、Q2 は 4 つの可溶化脂質を含むエタノール相を表します。

また、FRR (流量比) を関係 \(QR = \frac{{Q_{1} }}{{Q_{2} }}\) によって定義します。研究のほとんどは、FRR = 3、つまりエタノール溶液流量の 3 倍の水流量に焦点を当てました。総流量 Q は 0.2 から 20 ml/min まで変化しました。特性速度 U を、総流量 Q を入口チャネル断面積、つまりリング 1 の直前で割ったものとして定義します (図 1 を参照)。レイノルズ数とディーン数は次の式で定義されます。

ここで、h はチャネルの高さ、ν は水の動粘度、R はトーラスの曲率半径です。私たちがテストした流量範囲では、レイノルズ数は 10 ～ 1100 の範囲であり、ディーン数は 4 ～ 400 の範囲でした。したがって、壁の粗さの微調整が必要な可能性がある乱流の発生状況を大幅に下回っていました。次元の観点から見ると、私たちのシステムは、拡散プロセスを特徴付けるアスペクト比および無次元の数値とともに、これら 2 つの数値に依存します。パラメータ空間は大きいため、この論文では、無次元数を使用して結論を一般化することはせずに、流量の関数として観測値をプロットします (実用的な観点からすると、これは便利です)。

流体モデル実験では、視覚化技術を使用して混合プロセスの特性評価が実行されました。一方の入口にはフルオレセインが注入され、もう一方の入口には染料が含まれていない流体が注入されました。このシステムは、480 nmの光源と520 nm、つまり発光ピーク付近のカメラフィルターを備えた蛍光顕微鏡で観察されました。

文献 19 で古典的に行われているように、蛍光強度場の研究により、混合に関する情報が得られます。同様に、混合指数 H を次の式で定義します。

ここで、y は流れを横切る座標、w はチャネル幅、\(I_{mean}\) はチャネル幅全体の平均強度です。定義上、H が 1 に近い場合、混合度は高くなります。逆の場合 (H が小さい)、混合は低くなります。

まず、流量比 FRR を 3 に保ち、低い流量を検討しました。この値の選択は、後で示すように、DNA または RNA の送達に適切なサイズの LNP の形成が可能になるという事実によって動機付けられました (約 100 nm）、狭いサイズ分布、および優れたカプセル化効率。低流量における蛍光場の典型的な画像を図 3A に示します。

(A) 総流量 Q が 0.2 ml/min の場合のマイクロミキサーの蛍光場。挿入: 染料が拡散なしで流線に従った場合の理論的なトレーサー分布 (再循環はないと仮定)。 (B) Q = 0.2 (白丸) および 0.3 (×) ml/分のシステムの出口セクションの強度プロファイル。破線は拡散層の中心を示し、灰色の領域は「材料」セクションで説明したウェッジを示します。測定は出口チャネル、つまり 4 番目のリングの下流で実行されました (破線を参照)。グレーゾーンはチャネルウェッジです。

図 3 では、エタノール溶液の流量 Q2 は 0.05 ml/min、水は 0.15 ml/min に等しい流量 Q1 で注入されるため、合計流量 Q = Q1 + Q2 は 0.2 ml/min になります。分。上で述べたように、流量比 FRR は 3 に等しい。図 3 は、収集入口チャネル内で 2 つの流体が並行して移動することを示しています。図３Ｂの強度プロファイルは、拡散層の存在を示している。測定された拡散層の厚さは 60 µm 程度で、誤差関数 (ここで、D はエタノール中でのフルオレセインの拡散定数 (2 10-10 m2/s)、T は移動時間 (0.2 ml/min で 30 ms)) です。この式により、厚さ l は 30 μm 程度となります。係数 2 は、低流量でもシステム内に存在し、入口に局在しているか、リングに沿って発達している弱い再循環の作用によるものであると考えられます。これらの再循環がどんなに小さくても、拡散輸送を大幅に強化する可能性があります。

したがって、図 3A は、エタノールと水が並んで流れることを示しています。このような体制では、次の式が成り立ちます19,20。

ここで、μe とμw はそれぞれエタノールと水の粘度です。式によれば、フルオレセインとエタノールの混合物がチャネル幅の 30% を占めることになります。これは、拡散層の中心を示す破線がチャネル幅の 35% の位置にある図 2 とよく比較されます。図 3A の挿入図は、渦巻き運動がなく、拡散が無視された場合に予想される流れのパターンを示しています。

FRR = 3 のまま、総流量 Q が 0.7 ～ 4 ml/min の範囲で増加すると、時間平均濃度プロファイルは、2 つの流量の差があったにもかかわらず、ある流量から別の流量まで実質的に変化する複雑な形状を採用しました。連続した値は 10% 程度でした。したがって、この領域には大きな変動性があります。この領域を「移行領域」と呼び、対応する体制を「移行体制」と呼びます。図 4A は典型的な濃度場を示し、図 4B はこの領域で得られ、出口マイクロチャネル内で再度測定された典型的な濃度プロファイルを示します (矢印を参照)。

Q1 = 1.5 ml/min (水) および Q2 = 0.5 ml/min (エタノール) でエタノールによってデバイス内に輸送されたフルオレセインの蛍光場: (A) 蛍光場の瞬間画像。 (B) 4 回目のリング (矢印を参照) の後、つまり出口チャネルで測定された時間平均 (1 分以上) の強度プロファイル。グレーゾーンはチャネルウェッジです。

この場合、トレーサーはチャネルに侵入しましたが、完全には侵入しませんでした。1 分間の時間で平均された濃度プロファイルは、中心線の周りで顕著な低下を示しています。したがって、一部の領域はよく混合され、他の領域はあまり混合されないため、混合は完全ではありませんでした。重要な観察は、移行領域では、フルオレセインが最初のトーラスに入る前にチャネルに侵入したことです。これは、2 つの流体が出会う接合部で輸送機構が発達したことを示唆しています。図 3A に示すように、下流に進むにつれて色素濃度は均一化する傾向がありましたが、図 3B に示すように出口チャネルには不均一性が依然として残りました。

1 ～ 4 mL/min の範囲で観察された興味深い特徴は、図 5 に示すように、時間依存の現象が存在することでした。

(A) Q = 1.5 ml/min でリング 2 の直前に撮影された瞬間蛍光画像。常に FRR を 3 に保ちます。(B) 左図の矢印で示された点で測定された瞬間強度。鋭い界面の位置は時間とともに変化し、強度-時間プロットに現れる局所蛍光強度の振動を引き起こしました。プロットに示されている流量に対応するレイノルズ数は、最低流量から最高流量まで、11、80、および 330 です。

図 5 を得るために、さまざまな流量に対する固定点での蛍光の瞬間強度を測定しました。測定点の位置は、図５Ａにおいて白い点で示されている。図 5B は、0.2 ml/min では局所強度の顕著な振動がなかったことを示しています。 1.5 ml/分では、フルオレセイン/水界面の変位によって引き起こされる局所的な振動が見られました。流量が高くなると振幅は消失しました (6 ml/min での曲線を参照)。これらの測定は、システム内に時間依存の現象が存在することの証拠を提供します。それらは、およそ 1 ～ 4 ml/min の狭い範囲の流量で発生しました。我々は、より大きな流量では流れは依然として不安定だったが、現在カオス混合で観察されているように、蛍光場に縞模様を形成する傾向がある流体力学的振動19と、それを効率的に平滑化する分子拡散との間の結合により、最終的には均一な濃度場。完全な混合の限定的なケースが図 6A によく示されています。

(A) Q = 20 ml/min のマイクロミキサーによって発生した蛍光場。 (B) 6 (丸)、14 (×)、および 20 (プラス) ml/分に等しい Q について得られた 3 つの時間平均濃度プロファイル。グレーゾーンはチャネルウェッジです。

この図は、最初のリングの周囲の小さな領域を除いて、トレーサーがデバイス全体に均一に広がっていることを示しています。対応する濃度プロファイルを図 6B に示します。3 つの流量、6、14、および 20 ml/min で、依然として FRR = 3 を維持しています。これらのプロファイルは、出口に近い収集チャネルのレベルで再度測定されます (図 6B を参照)。図6Aの破線）、互いに折り畳まれます。

図 7 は、流量比 FRR = Q1/Q2 を 3 に保ちながら、選択した 3 つの領域を含む流量範囲について出口チャネルで測定した、以前に定義した均一性係数 H の推移を表しています。

FRR が 3 に等しい場合の総流量 Q の関数としての混合指数 H の変化。フルオレセインの典型的な瞬間画像を使用。各ポイントは 1 分間の平均から得られます。目を誘導するためにフルラインがプロットされています。

データは片対数スケールでプロットされており、上記のように、ウェッジが生産プロセスに大きく寄与しないことを考慮して、ウェッジを除外することによって均一性係数 H が得られました。これらの測定から特定された 3 つの体制は次のとおりです。

Q < 0.4 ml/min: 混合が不十分で、並列した流れに関連します。均一性係数 H は小さく、約数パーセントです。この体制の対応する上部レイノルズ数は 22 です。

0.4 < Q < 4 ml/min: 複雑な濃度プロファイルおよび時間依存現象を伴う、適度な混合に関連する移行領域。均一性係数 H は 20 ～ 80% の間にあります。レイノルズ数に関しては、領域の範囲は 22 ～ 220 です。振動の特性時間と比較して長時間にわたって平均化されたとしても、ある測定から別の測定までの H の変動は、流れが不安定なシステムの典型的なものです。開発する。この分散は、流れ条件による濃度プロファイルの変動に関する上記の指摘と一致しています。

Q > 4 ml/min: 80% を超える均一性係数と平坦で再現可能な濃度プロファイルを備えた高度に混合された領域。レイノルズ数の範囲は 220 と実験で到達した最大値、つまり 1100 の間にあります。

図 7 について説明する場合、図 1B に示すようにシステムを 2 つの部分に分割するのは興味深いことです。

セクション 1: V ジャンクションと最初のリングへの接続チャネルを含む入口領域。

セクション 2: リング、2 つの連続するリング間の接合部、および出口マイクロチャネルを含むシステムの残りの部分。

私たちの観察は、2 つの混和性流体が T 字路で直線チャネルに注入されたミナコフ 18 の観察と比較できます。したがって、T 字路ではなく Y 字路を使用したことを除いて、ジオメトリは私たちのものと似ていました。この研究の結果は実験的に定性的に確認されました21。これらの参考文献によると、Re ≈ 20 と推定される特定のしきい値を超えると、接合部で対称的な S 字型のディーン型渦が発生します。このしきい値は私たちのしきい値 (22 と推定) に近いです。この領域を超えると、Re ≈ 150 まで非対称の定常パターンが発生します。240 で振動不安定性が発生し、鞍点の周期的な変位が誘発され、ポアンカレ・メルニコフシナリオによれば、カオス的混合が生じます。実際、ミナコフの研究は、時間依存の流れの開始直後の効率的な混合を示しています18。このレイノルズ数の範囲は、我々が「遷移領域」と呼んだ領域と一致しています。この領域では、側流領域が保持されず、混合が中程度で、不均一性が存在し、振動が発生します。私たちの場合、移行レジームは 22 ～ 220 に等しいレイノルズ数に及びます。これはミナコフの結果ほど広範囲ではありませんが、一致しています。したがって、私たちの「移行体制」には、成形された渦、非対称な渦、および振動する渦が含まれると示唆できます。振動渦は、混合の観点から非常に効率的であることが知られています19。これは、なぜ振動が始まる直前に、私たちが「高度に混合した状態」と呼ぶ状態に達するのかを説明するかもしれません。したがって、ミナコフの研究との比較は、マイクロミキサーの動作を半定量的に理解するための手がかりを提供します。

4 つの環が色素の均質化を改善するという証拠があります。これは図 5 に示されており、装置の入口における不均一性は下流に進むにつれて平滑化される傾向があることを示しています。リングでは 2 つの部分に分けることができます。1 つはリング自体 (パート 1)、もう 1 つは収集チャネル、つまり 2 つの流体が再び合流する領域 (パート 2) です。接合部 (つまり、パート 2 または V 入口) と比較して曲率が小さいため、パート 1 はおそらく混合において小さな役割を果たしており、したがって発生する可能性のあるディーン渦も弱いと考えられます。一方、パート 2 は Y 字路とみなすことができ、入り口と同様の役割を果たし、ミキシングを向上させます。実際、私たちが行った実験的観察は、混合イベントが最初に入口、つまりセクション 1 で始まることを示唆しています。 1 をリングのパート 2 で繰り返します。したがって、パート 2 は、ミキシングに関してパート 1 で行われた作業を補完するものであるが、ミキシングを開始するものではないと示唆できます。

ここで我々が取り組む問題は、以前に分析された混合特性と同じマイクロミキサーで得られた LNP 特性との間の関係です。これらの調査を実行するために、LNP-pDNA モデルが使用されました。 LNP は、すぐに使用できる市販の gWiz-GFP プラスミド 22,23 と、イオン化脂質/DSPC/コレステロール/PEG 脂質の最適モル比 50/10/38.5/1.5 および N を備えた 4 つの異なる脂質を使用して作製されました。文献２４、２５に記載されているように、ｐＤＮＡのリン酸基に対するイオン化脂質のアミン基の／Ｐ比は６である。 MC3 イオン化脂質 (DLin-MC3-DMA) が選択されたのは、これが臨床的に最も進歩したオリゴヌクレオチド送達システム 26,27 であり、市販もされているためです。すべての成分間のモル比は一定に保たれ、文献に従って選択されました。

したがって、我々は、LNP サイズ、サイズ変動性 (PDI - 多分散指数)、ζ ポテンシャル、およびカプセル化効率 (EE) に対する総流量 Q の影響を調査しました。この研究は、以前に定義された「LNP 実験」を表します。これらの重要な特性は通常、プロセスを制御し、最終製品の有効性と安全性を確保するために、開発の初期段階から測定されます。文献によると、理想的には、最適な生体内分布と効率的な薬物送達を確保するには、LNP サイズは約 100 nm 以下である必要があります 28。製品の均一性を証明するには、PDI が 0.2 未満である必要があります。高いプロセス収率と核酸保護を確保するには、ゼータ電位はわずかに負であり、カプセル化効率が可能な限り高くなければなりません。

これらのパラメータと流量条件との相関関係を分析するために、0.4 ml/min から 20 ml/min の範囲の 5 つの流量 Q が研究されました。これらの実験では、上記と同じ方法で、水流と溶媒流の比率を 3 に維持し、総脂質濃度 (1.44 mg/l) と化学組成を一定に保ちました。データを図 8 に示します。

0.4 ～ 20 mL/min の流量によるさまざまな量の変化 (A) LNP サイズ。 (B) PDI (LNP の多分散指数)。 (C) カプセル化効率。

図 8A は、低い Q (< 1 ml/分) でより大きな粒子が得られたことを示しています。サイズが減少すると思われる移行ゾーンの後、より高い流速、すなわち 4 ～ 20 ml/min で粒子サイズは約 100 nm のプラトーに達しました。その間、ナノ粒子分散度（ＰＤＩ）は流量の増加とともに減少し、Ｑ＞４ｍｌ／分では７％で横ばいになった（図８Ｂを参照）。並行して、２ｍｌ／分未満ではＥＥは約６０％であったが、４ｍｌ／分を超えるより高いＱで形成された粒子のＥＥは約８０％であった（図８Ｃを参照）。これらの結果は、私たちが行った混合研究の結果と一致しました。図 7 で選択した 3 つのゾーンの境界、つまり、混合が不十分な領域、遷移領域、および混合が高度な領域を同じグラフ上にプロットしました。特に、LNP 構造の特性はデバイスの混合特性とよく相関しています。さらに、実効表面電荷 29 を示す ζ 電位も測定されました。使用した流量に関係なく、すべての LNP は pH 7.4 で ζ = − 13 mV + /− 4 mV のゼータ電位を示し、したがってわずかに負でした。測定値は Ref25 と一致しており、イオン化脂質の正電荷の損失が示唆されました。

実際的な観点から、混合が満足のいくものではない場合（つまり、均一性指数 H が 80% 未満の場合）、作成される構造の特性は最適ではないが、混合が高い場合には最適な特性に達すると結論付けることができます。 (H が 80% より大きい)、強度プロファイルはチャネル全体で均一です。遷移ゾーンより上、より具体的には、振動流が発生する条件よりも実質的に上で作業すると、最適な LNP が得られると考えられます。

Roces et al.5 で説明されているように、流量比 FRR の役割に取り組むことが重要です。図 9 は、総流量 4 ml/min および 1 ～ 10 まで変化する FRR のさまざまな値について、LNP 直径 D、PDI、およびカプセル化効率 EE について得られた結果を示しています。

総流量 Q = 4 ml/min で得られたグラフ。 (A) FRR (すなわち、水とエタノール溶液の流量比) の関数としての LNP 直径 D。挿入図: FRR の関数としての PDI。 (B) FRR の関数としてのカプセル化効率 EE。挿入図: FRR の関数としての均一性係数 H。 (C): \(\varepsilon_{m} = \frac{{FRR\varepsilon_{w} + \varepsilon_{e} }}{FR + 1}\) の関数としてプロットされた正規化された量。 \(D^{*} = 1 + 4\frac{{D - D_{\infty } }}{{D_{\infty } }}\left( + \right);\) \(PDI^{*} = PDI/PDI_{\infty }\)(o) および \(EE^{*} = E_{\infty } /EE\) (x)。

FRR が 2 より小さい場合、LNP 特性は (上で定義した意味で) 「最適」ではありません。直径は 100 nm (図 9A) を超え、EE は低く (図 9B の挿入図)、PDI は高くなります (図 9C)。が観察されました。より大きな FRR では、最適な特性、つまり 100 nm に近い直径、大きな EE、および小さな PDI (6% 程度) が回復しました。図９Ｂの挿入図に示すように、すべての場合、すなわちすべてのＦＲＲにおいて、混合が高かったことに留意することが重要である。均一性係数Ｈは平均して約８０％であった。 FRR < 2 の LNP の構造的病状の原因は、混合が不十分だったことによるものではないと推測できます。

図 9C により、説明が可能になります。エタノール (比誘電率 εe = 25) と水 (比誘電率 εw = 78) を混合すると、混合物の実効 (比) 誘電率は \(\varepsilon_{m} = \frac{{FRR\) に等しくなります。バレプシロン_{w} + \バレプシロン_{e} }}{FR + 1}\)。図10Cは、\(\varepsilon_{m}\)の関数として正規化された形式での直径D、PDI、およびカプセル化効率EEの推移を示しています。具体的には、次の量を表しました: \(D^{*} = 1 + 4\frac{{D - D_{\infty } }}{{D_{\infty } }},\) \(PDI^{* } = PDI/PDI_{\infty }\)、および \(EE^{*} = E_{\infty } /EE\)、ここで '\(\infty^{\prime }\) は FRR で取得された値です> 4 mL/分。 FRR が高い場合、\(\varepsilon_{m}\) は水のそれに近く、LNP は最適な特性を持ちますが、FRR が小さい場合、\(\varepsilon_{m}\) は大幅に小さくなり、エネルギーの状況が見られます。 LNP の構成要素によって変化するため、これが自己組織化プロセスに影響を及ぼし、それによって LNP の形態に悪影響を及ぼすのではないかと仮説を立てることができます。この種の状況は、製剤に重要な量のエタノールが使用されている場合に発生します24、30、31、32。図 9C から、非最適ケースと最適ケースの間のクロスオーバーは、依然として Q = 4 ml/min の場合でも、60 に近い実効比誘電率 \(\varepsilon_{m}\) 付近に位置すると推定されます。これは、流量比 (FRR) は 2 程度です。

モル組成がそれぞれ 50/10/1.5/38.5 である MC3、DOPC、PEG 脂質およびコレステロールで構成され、異なる流量および FRR 3 で取得された LNP のクライオ TEM 画像。(A) で調製された LNP 4 mL/min での核酸の不在。 (B) 4 mL/min で p-DNA を使用して調製された pDNA-LNP システム。よりテクスチャーのある表面が示されています。 (C) 0.4 mL/min で調製された pDNA-LNP システム。サイズはより大きく、分布はより広範囲になります（小さい LNP と大きい LNP の存在を参照）。

この指摘から、最適な FRR は、水の極性に近い溶液の極性を維持するのに十分な大きさであると同時に、プロセスの収率が低下する高希釈に達しないように十分に小さい必要があることが示唆されます。

ここでは、4 mL/min および FRR = 3 の高度に混合された領域で生成されたナノ粒子の形態を分析します。比較のために、pDNA を含まない LNP (「空の」LNP) と pDNA を含む LNP を考慮して、cryo-TEM を使用しました。核酸 (pDNA LNP)。また、図 10 に示すように、混合が不十分なレジームの結果とも比較しました。

よく混合された領域では、cryo-TEM によって観察されたサイズ (100 nm 近く) は DLS 測定と一致しました。我々は、空のLNPが滑らかな球形をしているのに対し、pDNA LNPは波状の界面を示していることを発見した(図10B)。おそらく、脂質層上でのカプセル化された DNA 鎖の作用がこの現象を引き起こすと考えられます。いずれにせよ、図 10 の電子密度の高いコア構造は、文献 5、8、24、33 で報告されている機能性酸ベースの LNP と一致することがわかりました。したがって、高度に混合された条件および FRR = 3 では、我々が発見した構造は、文献で画像化された機能的 LNP と一致するという意味で「最適」であると結論付けることができます。 LNP が低混合条件 (0.4 mL/min、「並列方式」) で調製された場合、同じタイプの構造が観察されますが、図 8A と一致して、集団はより大きなサイズを採用し、より広い分布を持つように見えます。

上記の結果は、許容可能な LNP の品質 (小さいサイズ、低い PDI、弱い負の ζ 電位、および高い EE) が、LNP の配合に使用される 2 つの相の均質な混合物、より大きな均質係数を備えた 2 つの条件が満たされたときに得られることを示しています。混合物の平均比誘電率が 60 より大きくなるような相分布。これは、機能的な LNP を調製するために推奨される条件の範囲です。我々の結果は、ミキサーの形状とは無関係に、2 つの条件のいずれかが満たされない場合、LNP サイズ、サイズの均一性、およびカプセル化効率が最適値から大幅に異なることを示唆しています。

なぜ低流量で LNP が異常になるのかを尋ねるのは興味深いことです。最適な構造よりも大幅に大きなサイズと小さなカプセル化効率が得られます。図 3 の蛍光プロファイルは、2 つの流体を分離する厚さ 60 μm の拡散層の存在を示しています。この層の中心では、水/エタノールの比率は約 1:1 です。この領域では、最適な自己組織化条件が満たされていないと推測できます。一方、脂質と pDNA は水やエタノールよりも重いため、拡散が遅くなります。試薬が下流に移動するにつれて、脂質がこの準最適環境にさらされ、それによって沈殿する期間が発生します。この推論は、混合条件が不十分な場合に観察される異常なサイズと低い性能を説明できる可能性があります。

特に、我々が課した最大流量において、LNP は完全性を維持し、分解しなかったことを示しています。これは、高速 (つまり cm/s) にもかかわらず、LNP のスケール (つまり 100 nm) ではせん断応力が低いことに注目することで理解できます。システムのサイズを大きくした場合でも、LNP から「見える」せん断応力が実験と同じレベルのままであり、流れの状態が乱流よりも低いままであれば、流量を上げてスループットを高めることは難しくありません。発症。

最後に、この研究で得た理解を利用して、使用したミキサーのタイプに合わせて LNP を生成するための最適な条件を定義することを試みることができます。まず、高い混合を達成するには流量が十分大きくなければなりません。私たちのケースでは、最小流量 4 ml/min を提案できます。第二に、装置は混合プロセスが完全に進行するのに十分な長さである必要があります。私たちの研究では、横方向の寸法は 30 倍でも許容できることが示唆されています。最後に、FRR は、廃棄物を生成する高い希釈率で操作することなく、水に近い媒体極性を維持するのに十分な大きさでなければなりません。私たちのシステムでは、3 程度の FRR を提案する場合があります。

この論文では、Y ジャンクションと 4 つのリングを組み込んだデバイスに沿って進行する混合プロセスをある程度詳しく分析しています。 LNP の文脈では、これは初めてのことです。私たちが分析するデバイスは、慣性マイクロミキサーのカテゴリーに属します。つまり、慣性 (ディーン) 渦の作用を利用し、その間は乱流開始温度以下で動作するマイクロミキサーです。これらのミキサーは、大量生産を想定するための重要な条件である高スループットによく適応しています。このようなスループットは、たとえばヘリンボーンマイクロミキサーでは達成できません。この論文では、ミナコフらの数値研究に近い、時間依存現象が特定のしきい値を超えると発生することを示しました。 LNP 測定と合わせた混合プロセスの分析は、機能構造を製造するための最適条件には、時間依存現象の開始を大幅に上回る流量が必要であることを示しています。その理論的根拠は、カオスに関する文献 (参考文献 19 などを参照) で確立されているように、振動渦が効率的な混合を引き起こすということです。ここで提案する基準 (振動流域の開始を超えて動作する) は一般的なものであると考えられます。これは、LNP 製造専用の高スループットマイクロミキサーの設計に役立つはずです。

現在の研究中に分析されたデータセットは、合理的な要求に応じて責任著者から入手できます。

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著者らは、パリ市庁舎、SANOFI、ESPCI、CNRS、PSL、および IPGG の支援に感謝します。彼らは、議論してくれた MMX グループのメンバーと、数値について提供してくれた L. Dehove に感謝します。

この言葉は、CNRS、PSL、IPGG プラットフォーム、ESPCI によってサポートされており、SANOFI による助成金によってサポートされています。

BioDPD 部門、SANOFI、13 Quai Jules Guesde、94400、ヴィトリー・シュル・セーヌ、フランス

マノン・リポル、マチルド・エノット、オスカー・ロブ、キアラ・ラピサルダ、ジャン＝ルネ・オートラン、モスタファ・ナカシュ、ピエール・ヴィルス

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エリアン・マーティン & パトリック・タベリング

REI 部門、サノフィパスツール、1541 Av. Marcel Mérieux、69280、マルシーレトワール、フランス

マリ＝クレール・ニコライ＆オーレリー・デリオ

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MR、EM、ME、OR、CR、MCN、AD が実験を行っていました。 PT、JRA、MN、PW はその結果について議論し、プロジェクトを管理しました。

パトリック・タベリングへの通信。

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転載と許可

Ripoll、M.、Martin、E.、Enot、M. 他。リングマイクロミキサーにおける脂質ナノ粒子 (LNP) の最適な自己集合。 Sci Rep 12、9483 (2022)。 https://doi.org/10.1038/s41598-022-13112-5

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受信日: 2022 年 2 月 9 日

受理日: 2022 年 5 月 20 日

公開日: 2022 年 6 月 8 日

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-022-13112-5

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